光绪帝是被慈禧太后毒杀的。

下毒时间是1908年11月10日（光绪三十四年十月十七日）傍晚5点钟左右。

光绪皇帝在中毒当晚向内务府发出了两道紧急召医的手谕，但是内务府带来的医生当晚被阻拦在中南海宫门外，未能进入瀛台为光绪帝诊治。次日早晨西医屈桂庭进入瀛台，发现光绪帝腹痛难忍在床上打滚，且“面黑，舌黄黑”，并断言此症状“与前病绝少关系”。但是屈桂庭也未对此时中毒垂危的光绪帝进行任何救治，仅仅进言“以暖水熨敷腹部”便匆匆退出。此后，虽有其他御医进入瀛台为光绪帝诊治，但是所开方药无一味对症。1908年11月14日（光绪三十四年十月二十一日）晚6时33分左右，光绪帝去世。

在光绪帝喝下毒药，尚未发作时，慈禧太后已经命人将皇帝梓宫停在乾清宫，预备发丧（慈禧太后估算光绪帝当晚即死，没有想到光绪帝在中毒后仍然坚持了四天）。由此可以判定，下毒之人必为慈禧太后，因为其他人没有调动皇帝梓宫的权力。

具体考证过程，请看国家清史委员会编纂的《清光绪帝死因鉴证》。