测蛋白质含量的方法及其原理

发布时间:2023年7月17日 00:57

测定蛋白质含量是生物化学、分子生物学等科学研究领域中的基础方法之一。测定蛋白质含量的方法和原理有多种,下面将就主要的几种方法和原理进行阐述。

(一) 比色法

1. 原理

由于蛋白质分子中含有苯环、甲硫氨酸、色氨酸以及铜、铁等离子对物质的吸收具有明显的增强作用。当蛋白质与Biuret试剂中的Cu2+络合物形成复合物后,产生的增强作用,使得Biuret试剂在紫外光区带有明显的吸收峰,洛氏试剂在625nm波长处有吸收峰,而且与蛋白质含量呈线性关系。由此,可以利用比色法快速、准确测定蛋白质含量。

2. 操作步骤

a. 取需要测定的蛋白质含量的标样及待检样品0.1ml,分别加入试管中。

b. 加入相同数量的Biuret试液,混匀。

c. 放置5~10min后,读取625nm处的吸光度。

d. 用标准蛋白质溶液绘制标准曲线,计算待测样品中的蛋白质含量。

(二) 低丝氨酸比色法

1. 原理

低丝氨酸是一种微酸性氨基酸,常常作为一种代表性氨基酸来测定蛋白质。低丝氨酸和硫酸在浓硫酸作用下产生的颜色与低丝氨酸的数量成正比,可以通过比色法来测定。

2. 操作步骤

a. 取需要测定的样品0.1ml,在玻璃管中加入0.9ml低丝氨酸溶液和0.1ml浓硫酸。

b. 震荡混匀后放置10min。

c. 读取540nm处的吸光度。

d. 用标准低丝氨酸溶液绘制标准曲线,计算待测样品中的蛋白质含量。

(三) 紫外吸收法

1. 原理

蛋白质分子中含有苯环和氨基酸的骨架,可以吸收紫外线,是紫外吸收法测定蛋白质含量的主要原理。

2. 操作步骤

a. 取需要测定的样品0.1ml,在紫外吸收仪中读取280nm处的吸光度。

b. 用标准蛋白质溶液绘制标准曲线,计算待测样品中的蛋白质含量。

(四) 氮素测定法

1. 原理

蛋白质成分的氮素含量远高于其他有机物质,利用蒸发测氮原理可以测定蛋白质含量。将样品用硫酸等试剂消化,将其中的蛋白质氮掉以上清液的形式收集,在加入酸性氧化剂,在弱碱性环境下,使还原铜向氧化铜转化,在水溶液中,氧化铜与氮原子反应形成棕色沉淀,测定其重量即可计算出样品中的蛋白质质量。

2. 操作步骤

a. 取需要测定的样品0.1ml,用硫酸等试剂消化。

b. 消化后在蒸发器中将其浓缩到小气泡冒出,结晶水失去。

c. 加入酸性氧化剂,在弱碱性环境下,还原铜向氧化铜转化。

d. 在水溶液中,氧化铜与氮原子反应形成棕色沉淀,在常温下干燥到恒定重量。

e. 用标准蛋白质溶液绘制标准曲线,计算待测样品中的蛋白质含量。

(五) Bradford法

1. 原理

当蛋白质分子和Bradford试剂(一种含有草酸和染料成分的混合溶液)混合时,蛋白质分子的苯环和草酸结合形成强吸收的色素络合物,可利用此反应来测定蛋白质含量。

2. 操作步骤

a. 取需要测定的样品0.1ml,在试管中加入Bradford试剂。

b. 混合后,在595nm处读取吸光度。

c. 用标准蛋白质溶液制作标准曲线,计算待测样品中的蛋白质含量。

总之,选择合适的方法来测定蛋白质含量,可以根据实验的目的和要求来决定。当测定精度和速度是主要因素时,一般选择Bradford法、Biuret法和低丝氨酸比色法等比色法。当不能完全去除干扰物时,可以选择紫外吸收法。对于含多糖杂质的复杂样品,可以使用氮素测定法。