BCA法(Bicinchoninic Acid Assay)是一种快速、敏感、比较精确的蛋白质浓度测定方法。它是通过检测蛋白质中的蛋白质骨架氨基酸和含硫氨基酸与双香酮染色剂之间的配位作用而进行蛋白质浓度测定的。下面是BCA法测蛋白浓度的步骤:
步骤1:制备标准曲线
将一定浓度的蛋白质标准品如牛清蛋白(BSA)溶于不含离子的缓冲液中,制成不同浓度的标准品,如0、0.5、1、2、4、8 μg/ml等。取10 μl、20 μl、40 μl、80 μl、160 μl、320 μl的标准品分别加到96孔板的6个孔中,加入200 μl预先配好的BCA试剂溶液。
步骤2:测量样品的蛋白含量
将各种待测样品分别加入到96孔板中。每个样品加入200 μl预先配好的BCA试剂溶液,液体中含有的蛋白质与试剂反应后,在560nm左右处将产生比较明显的吸光峰(或者使用90°C下反应10分钟)。使用比色计或者多功能酶标仪在560nm处测量各个样品的吸光度值,记录下平均吸光度值。
步骤3:计算结果并制作标准曲线
将各个样品的吸光度值代入标准曲线中得出蛋白质浓度值。标准曲线的制作可以选用计算机软件或手工计算。将所得的浓度值进行平均,即为该样品的蛋白质含量。
总之,BCA法是一种快速、灵敏、精确的蛋白质浓度测定方法,它适用于各种类型的蛋白质,包括纯化后和混合的蛋白质,可以在生物化学、分子生物学、免疫学和生物技术等领域中广泛应用。