蛋白质是一类重要的生物大分子,其在组织细胞内发挥着非常重要的生物学功能,包括构成细胞器、酶、激素和免疫球蛋白等。因此,准确测定蛋白质含量对于研究生物学和生物医学问题具有极为重要的意义,具体测定方法有很多,其中以BCA法、Lowry法和Bradford法最为常用。这三种方法目前在国际上被广泛采用,并已被纳入了国家标准规范中。
1. BCA法测定蛋白质含量
BCA法全称是双乙酰基胺基苯甲酸法(Bicinchoninic Acid assay),早在20世纪80年代初,Smith等人就建立了BCA法测定蛋白质含量的方法,其基本原理是蛋白质中的蛋白质质子和Cu2+发生络合,生成一种紫色的络合物,在650 nm处具有最大的吸光度。BCA法的优点是灵敏度高、稳定性好、使用方便、反应时间短,这也是为什么BCA法已经成为了评价蛋白质测定方法的主要标准之一。此法的分析范围从0.5 ug到2000 ug的蛋白质都可以使用。
2. Lowry法测定蛋白质含量
Lowry法是最早的蛋白质含量测定方法之一,由Lowry等人于1951年首次提出。其基本原理是蛋白质中与碱性染料离子(Cu2+、Fe3+)发生络合,使得分光光度计在750nm处产生吸光度峰。Lowry法的优点是反应快速,灵敏度高(10-1000 ug/mL),线性范围大,然而其劣势在于产生很多干扰物,而且使用过程中需要诸多试剂,操作较为复杂。
3. Bradford法测定蛋白质含量
Bradford法最初的名字是Bradford染色法,由Bradford等人于1976年首次报道。其基本原理是在试样中加入Bradford试剂(一种含有双取代的染料),以周波光谱测量特异吸收最大值595nm的蓝色复合物,该颜色与蛋白质含量呈线性关系,从而测定蛋白质的含量。该方法因为反应时间短(5分钟内),操作简单,且灵敏度不错(在1-20ug/mL蛋白质浓度范围内),并且能够消除测定困难等优点,,因此一直广泛应用在蛋白质测定中。
总的来说,上述三种方法均有各自的优点和劣势,在实验操作中需要选择最适合自己研究对象并且技术成熟的方法进行实验,以保证测量的精确度和准确性。同时,国家标准规范也要求常见蛋白质测定方法在操作中能够避免其中的误差并保证数据的可重复性。