蛋白质磷酸化是一种重要的蛋白质修饰方式，它涉及到多种信号转导通路、细胞周期、生长发育和细胞凋亡等生物学过程。因此，检测蛋白质磷酸化水平对于研究这些生物学过程具有重要意义。本文将从检测原理、方法和技术进展等方面介绍蛋白质磷酸化的检测方法。
一、磷酸化蛋白检测的原理
磷酸化蛋白的检测，首先要选择特异的抗体识别磷酸化特异的氨基酸残基，如丝氨酸（serine）、苏氨酸（threonine）和酪氨酸（tyrosine）这些容易被磷酸化的残基。这些抗体通常称为磷特异性抗体（phospho-specific antibody）。
在蛋白质磷酸化水平检测中，常常采用Western blot方法进行分析。Western blot是一种常用的检测蛋白质的分析方法。其基本原理是将待测蛋白质样品经SDS-PAGE分离后转移到薄膜上，然后用特异性的抗体标记待测蛋白质，最后通过化学反应使蛋白质被可见化。
二、磷酸化蛋白检测的方法
1. Western blot方法
Western blot方法是一种磷酸化蛋白检测的成熟方法。通常需要进行以下操作：
（1）样品处理：根据需要将细胞或组织样品处理成蛋白质，可采用开裂细胞破碎液、提取液或磷酸化溶液等。
（2）蛋白质定量：量化待测蛋白质浓度，常用的方法有Bradford法、BCA法等。
（3）SDS-PAGE电泳：将定量好的蛋白质样品经过SDS-PAGE电泳分离。
（4）转膜：将SDS-PAGE胶片转移到聚丙烯酰胺薄膜上。
（5）封闭：用5%牛奶粉溶液封闭非特异性蛋白结合。
（6）一抗孵育：加入磷特异性抗体孵育，用于捕获磷酸化蛋白。
（7）二抗孵育：加入特异性的二抗标记，该二抗与前面的一抗结合，用于检测磷酸化蛋白。
（8）显色：将薄膜放置于显影液中，使蛋白质可见。
2. 质谱检测法
质谱（MS）是另一种常用的磷酸化蛋白检测方法。它不同于Western blot等传统方法，质谱技术采用第二阶段飞行时间（TOF）仪或三重四极杆质谱仪（Q-TOF）仪器，对具有氨基酸残基磷酸化突变的多肽进行检测。
磷酸化的肽段通常比不具有磷酸化的肽段具有不同的质量、离子化和碎片情况。利用质谱技术可以测定其质量和碎片情况，从而鉴定肽段是否磷酸化。
3. 免疫组织化学技术（IHC）
免疫组织化学技术也是常用的检测蛋白质磷酸化的方法之一。该技术可用于检测蛋白质在组织样本中的定位和表达量。
通过磷特异性抗体标记，实现对组织切片的蛋白质磷酸化水平的分析。与Western blot方法和质谱分析相比，IHC方法优点在于可以直接检测磷酸化的蛋白质在组织中的表达、定位和活性等信息。但相对的，它也需要更多的技术和设备。
4. 磷酸化专一型原位杂交（PSISH）
磷酸化专一型原位杂交（PSISH）技术，是一种应用于医学领域中的诊断方法，主要用于针对靶向药物治疗的控制。PSISH技术是一种DNA双链沉积杂交技术，可用于检测特定磷酸化位点的mRNA。
该方法适用于磷酸化位点是反式、同上或异构的情况。相对于其他方法，PSISH技术具有优点在于可以分析特异性的磷酸化位点，同时还具有灵敏度高、检测速度快等优点。但其操作也较为复杂，需要特殊的设备和技术支持。
三、磷酸化蛋白检测的技术进展
磷酸化蛋白的检测技术实现了快速的发展，已经涌现出一些新的检测方法。
1. 单分子分辨显微镜技术（SMLM）
单分子分辨显微镜技术（SMLM），是一种高分辨率成像技术，其分辨率可以达到10-20 nm。这种技术利用荧光染色剂或纳米颗粒标记磷酸化蛋白，并基于反射抑制的效应，使它们的位置被单个荧光信号识别和定位。
SMLM技术可以用于磷酸化蛋白的检测，已成为当前比较活跃的研究领域之一。该技术可用于检测细胞内的特定蛋白质磷酸化位置，并定量分析磷酸化蛋白在细胞内的表达水平。
2. 未标记正交飞行时间二维液相色谱（LC-MS/MS）
未标记正交飞行时间二维液相色谱（LC-MS/MS），是一种新型的磷酸化蛋白检测方法。该技术通过一系列的色谱分离，并结合液相质谱技术，实现对研究对象中磷酸化蛋白的分离和分析。与传统方法相比，该技术具有高效和精准的特点，可以用于更为精确地定量磷酸化的蛋白质，这对包括疾病诊断和新药研发等各个方面都具有非常重要的意义。
四、结论
总的来说，磷酸化蛋白的检测是生物学研究中一项很重要的工作。通过选择专一性特异的抗体，结合传统的Western blot等技术，以及现代的质谱检测、免疫组织化学技术、SMLM和LC-MS/MS等技术，可以实现对磷酸化蛋白水平、表达和定位的高灵敏、高精确和高效率的检测和分析。