SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate -Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)是一种常用的生物化学技术,广泛应用于蛋白质质量的分离、纯化、定量和鉴定。SDS-PAGE通过电泳技术,使蛋白质分子按大小分布形成不同的带状,从而测定蛋白质分子的分子量。那么SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理是什么呢?下面详细介绍。
一、SDS-PAGE的基本原理
SDS-PAGE所用的凝胶是聚丙烯酰胺,以丙烯酰胺为单体,通过聚合反应形成的三维网状结构,可以形成可靠的凝胶电泳专用载体。由于凝胶内部的孔径尺寸是一个连续的渐进变化,因此凝胶可以对具有不同的分子质量的蛋白质进行分离。
SDS-PAGE 分别采用两种聚合物,即聚丙烯酰胺凝胶和SDS(十二烷基硫酸钠),SDS是一种解离剂,具有疏水性,能够使蛋白质的剩余电荷中的羧酸与香豆酸根离子形成一个固定的负离子表面电荷,从而蛋白质带上一个相同的负电荷,这使得所有蛋白质分子的电荷-质量比都相同,能够很好的分离在凝胶上。
二、SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理
(1)将蛋白质样品加入牛丙酸 (Bromophenol Blue) 溶液,牛丙酸可以消除蛋白样的酸碱度差异,同时呈现出深蓝色,可以使样品与样品分离好区分。
(2)SDS在样品中起到断开蛋白质内部的非共价键,解离成一定比例的单体,从而消除不同蛋白质质量之间的差异;SDS会使所有蛋白质分子带有负电荷,在电场作用下,大分子会受到较强的阻力,迁移速度较慢,小分子的上尚亚麻顺利被带到基部聚集。
(3)电泳过程中,蛋白质样品带上负电荷,向阳极迁移,阳极产生氧化性反应,会产生酸性物质,使凝胶酸度降低,阻滞小分子的上尚亚麻,使大分子经在基部聚集的现象更加明化。
(4)在SDS-PAGE中,常常特意添加不同的蛋白质质量的标准品样品,通过和样品一起电泳,并呈现明晰的带状图形来进行定量和质量测定。
(5)通过标准品和实验样品显示的电泳图谱来推算出实验样品的相对分子质量。
三、SDS-PAGE测定蛋白质分子量的结果解读
通过SDS-PAGE分析,可以观察到蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶上的运动轨迹,在凝胶上的分子大小与其迁移的距离随之成反比例关系。通过聚合物网络空间约束作用下,大分子与小分子的迁移速度差异较明显。测定时以标准品和实验样品在聚丙烯酰胺凝胶上泳动的迁移率为基础,通过数据处理和统计学方法,推算出实验样品相对分子质量。
总之,SDS-PAGE测定蛋白质分子量是一种基于电泳技术的分离方法,通过将蛋白质带上相同的负电荷,将其分离。通过标准品和实验样品在聚丙烯酰胺凝胶上泳动的迁移率为基础,通过数据处理和统计学方法,推算出实验样品相对分子质量,能够广泛应用于蛋白质质量的分离、纯化、定量和鉴定的研究。